การโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ร่างกาย - สารานุกรมไทยสำหรับเยาวชนฯ
 
สารานุกรมไทย
สำหรับเยาวชน  เมนู 40
เล่มที่ ๔๐
เรื่องที่ ๑ พิพิธภัณฑสถาน
เรื่องที่ ๒ รางวัลซีไรต์
เรื่องที่ ๓ นกเงือกไทย
เรื่องที่ ๔ เห็ด
เรื่องที่ ๕ การโคลนนิ่งสัตว์
เรื่องที่ ๖ แร่เหล็ก
เรื่องที่ ๗ การใช้เลเซอร์ในทางการแพทย์
เรื่องที่ ๘ ไข้ออกผื่น
เรื่องที่ ๙ มะเร็งต่อมลูกหมาก

สารานุกรมไทยสำหรับเยาวชนฯ / เล่มที่ ๔๐ / เรื่องที่ ๕ การโคลนนิ่งสัตว์ / การโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ร่างกาย

 การโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ร่างกาย
การโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ร่างกาย

วิธีการโคลนนิ่งสัตว์โดยใช้เซลล์ร่างกายมีขั้นตอนดังนี้

๑. การเตรียมเซลล์ต้นแบบ
๒. การเตรียมไซโทพลาซึมผู้รับ
๓. การฉีดเซลล์ต้นแบบเข้าไปในไซโทพลาซึมผู้รับ
๔. การเชื่อมเซลล์ต้นแบบให้ติดกับไซโทพลาซึมผู้รับ
๕. การกระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัว
๖. การเลี้ยงตัวอ่อนโคลนนิ่งในหลอดแก้ว
๗. การถ่ายโอนตัวอ่อนโคลนนิ่งสู่แม่ตัวรับ

ในที่นี้เพื่อให้เห็นรายละเอียดขั้นตอนชัดเจน จะยกตัวอย่างการโคลนนิ่งโค โดยใช้เซลล์ใบหูเป็นเซลล์ต้นแบบ ดังต่อไปนี้

๑. การเตรียมเซลล์ต้นแบบ (Donor cell preparation)

โดยทั่วไปวิธีการโคลนนิ่งสัตว์สามารถใช้เนื้อเยื่อจากส่วนต่างๆ ของร่างกายสัตว์มาทำเป็นเซลล์ต้นแบบ เช่น ผิวหนัง กล้ามเนื้อ ตับ ไต ไขกระดูก โดยมีข้อกำหนดในเบื้องต้นคือ เนื้อเยื่อ เหล่านั้นต้องยังไม่เน่าเปื่อย ซึ่งหมายความว่า เซลล์ ที่อยู่ภายในเนื้อเยื่อยังมีชีวิตอยู่ เพราะต้องการนำเนื้อเยื่อเหล่านี้ไปเพาะเลี้ยงในห้องทดลอง เพื่อให้เซลล์ที่อยู่ภายในเนื้อเยื่อเจริญขึ้นมา

แสดงการเจริญของเซลล์ไฟโบรบราสต์กำลังขยาย ๑๐๐ เท่า ออกจากหนังหู (สีดำ)
การโคลนนิ่งโคนิยมใช้หนังหูของโคนำมาเพาะเลี้ยง เพื่อให้ได้เซลล์สำหรับทำเป็นเซลล์ต้นแบบ สาเหตุที่ใช้หนังหู เพราะเก็บได้ง่าย และไม่ทำให้บาดแผลอักเสบหลังการเก็บ โดยมีวิธีทำคือ นำโคที่ต้องการโคลนนิ่งมาเข้าซองบังคับ ซึ่งจะล็อกคอและหัวของโค ให้อยู่นิ่ง เพื่อทำการเก็บใบหู ด้วยการทำความสะอาดไขมันหรือสิ่งสกปรก ออกจากติ่งใบหูทั้งด้านบนและล่าง (บริเวณเดียวกับที่เจาะหูของสตรีเพื่อใส่ตุ้มหู) จากนั้นโกนขนที่หนังหูทั้ง ๒ ด้านและเช็ดฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ แล้วใช้เครื่องเจาะรูหู ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง ๔-๕ มิลลิเมตร เจาะหูเพียงรูเดียว หลังจากนั้น นำชิ้นใบหูที่ได้ เก็บไว้ในหลอดน้ำเกลือ ที่แช่ในถังน้ำแข็งในขณะนำกลับเข้าห้องปฏิบัติการ ซึ่งสามารถแช่หนังหูไว้ได้ไม่เกิน ๑๒ ชั่วโมง ระหว่างการขนส่ง

เซลล์ไฟโบรบราสต์กำลังขยาย ๒๐๐ เท่า
การปฏิบัติในห้องปฏิบัติการจะนำชิ้นใบหูมาเช็ดด้วยแอลกอฮอล์อีก ๒ ครั้ง หลังจากนั้นในขั้นตอนต่อจากนี้ไป จะทำในตู้ปลอดเชื้อ เพื่อป้องกันการติดเชื้อ คือ ใช้มีดผ่าตัดลอกหนังหูด้านบนและล่างออกจากกระดูกอ่อน แล้วตัดส่วนที่เป็นหนังขนาดประมาณ ๑×××๑ ตารางมิลลิเมตร นำไปวางบนจานเลี้ยงเซลล์ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง ๓๕ มิลลิเมตร และปิดชิ้นหนังหูด้วยกระจกแก้วที่ปลอดเชื้อ เพื่อไม่ให้หนังหูลอย เติมน้ำยาเลี้ยงเซลล์ ๕ มิลลิลิตร แล้วนำหนังหูไปเลี้ยงในตู้อบเลี้ยงเซลล์ที่มีอุณหภูมิ ๓๘.๕ องศาเซลเซียส นาน ๔ วัน จากนั้นนำเซลล์ที่เลี้ยงออกมาส่องตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ เพื่อดูการเจริญเติบโตและตรวจสอบว่ามีการติดเชื้อหรือไม่ หากไม่มีการติดเชื้อจะทำการเลี้ยงต่อ โดยจะเปลี่ยนน้ำยาที่ใช้เลี้ยงเซลล์ทุก ๓ วัน ลักษณะของ เซลล์ที่เจริญขึ้นมาใหม่ เป็นรูปกระสวยเรียงติดกัน เรียกเซลล์นี้ว่า เซลล์ไฟโบรบราสต์ (fibrobrast) ซึ่งเป็นเซลล์ที่เป็นหน่วยย่อยของผิวหนังหรือกล้ามเนื้อ

เมื่อเซลล์เจริญขึ้นมากแล้ว จะแยกเซลล์ออกไปเลี้ยงในจานเลี้ยงเซลล์ใหม่ เพื่อเพิ่มปริมาณเซลล์ให้มีจำนวนมากขึ้น ตามปกติ จะแยกเซลล์ไปเลี้ยงในจานเลี้ยงเซลล์ ๒ ครั้งเพื่อเลี้ยงให้ได้ ๑๐ จาน ซึ่งจะได้เซลล์เจริญขึ้นมาอย่างน้อย ๑๐ ล้านเซลล์ และนำเซลล์ไปแบ่งใส่หลอดแช่แข็งเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวให้ได้อย่างน้อย ๕๐ หลอด เมื่อต้องการโคลนนิ่ง จะต้องนำหลอดเก็บเซลล์ออกมาละลายในน้ำอุ่น แล้วนำเซลล์ออกมาเลี้ยงในจานเลี้ยงเซลล์ ๑-๒ วันก่อนใช้งาน จากนั้นใช้น้ำยาย่อย เซลล์แยกให้เป็นเซลล์เดี่ยวๆ และคัดเลือกเซลล์ที่มีรูปร่างกลมปกติ และมีขนาดไม่เล็กหรือใหญ่เกินไป (ขนาด ๑๔-๑๖ ไมครอน)  เพื่อใช้เป็นเซลล์ต้นแบบสำหรับการโคลนนิ่ง

การดูดไข่โคจากรังไข่
ที่ได้จากโรงฆ่าสัตว์
๒. การเตรียมไซโทพลาซึมผู้รับ (Recipient cytoplasm preparation)

ในการโคลนนิ่งจำเป็นต้องใช้ไซโทพลาซึมของไข่สุก ที่พร้อมปฏิสนธิมาทำให้นิวเคลียส ของเซลล์ต้นแบบโปรแกรมตัวเองใหม่ (reprogramming) เพื่อให้กลับมามีสภาพ เหมือนกับนิวเคลียสของตัวอ่อนระยะแรก ซึ่งในกรณีการโคลนนิ่งโค ก็จำเป็นต้องใช้ไข่โค มาทำเป็นไซโทพลาซึมผู้รับ โดยไข่จะอยู่ภายในรังไข่ ซึ่งสามารถเก็บ โดยการใช้เครื่องอัลตราซาวนด์เจาะดูดจากโค ที่มีชีวิตได้ทุกๆ สัปดาห์ แต่วิธีนี้ จะต้องเสียค่าใช้จ่ายในการเลี้ยงโค นอกจากนี้ เข็มที่ใช้เจาะไข่ และเครื่องอัลตราซาวนด์ ก็มีราคาแพง ทำให้ไข่มีต้นทุนสูง จึงใช้วิธีเก็บรังไข่โค จากโรงฆ่าสัตว์ ซึ่งมีต้นทุนที่ต่ำ ในระหว่างที่นำเข้าห้องปฏิบัติการ ควรเก็บรังไข่ไว้ในน้ำเกลือ ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นนำรังไข่มาดูดไข่อ่อน ที่อยู่ในถุงไข่ ขนาด ๓-๗ มิลลิเมตร ด้วยเข็มฉีดยาเบอร์ ๑๘ ที่ต่อกับกระบอกฉีดยา ขนาด ๑๐ มิลลิลิตร ไข่ที่ได้ยังเป็นไข่อ่อน จึงจำเป็นต้องนำมาเลี้ยงในน้ำยาสำหรับเลี้ยงไข่ให้สุก ในตู้อบเลี้ยงเซลล์เป็นเวลา ๒๐-๒๑ ชั่วโมง เพื่อให้ไข่เจริญเป็นไข่สุก ซึ่งจะมีโพลาร์บอดีที่ ๑ (1st polar body) ออกมาจากไซโทพลาซึม เมื่อไข่สุกแล้ว จึงนำมาทำการกำจัดนิวเคลียสออกไป ซึ่งต้องทำภายใต้กล้องจุลทรรศน์หัวกลับ กำลังขยาย ๒๐๐ เท่า โดยการใช้เข็มตัดเปลือกไข่ ที่อยู่เหนือโพลาร์บอดีที่ ๑ แล้วใช้เข็มกดให้ไซโทพลาซึมออกมาตรงเปลือกไข่ ที่ถูกตัด ไข่ที่ได้จะมีไซโทพลาซึม ที่พร้อมสำหรับการโคลนนิ่ง
๓. การฉีดเซลล์ต้นแบบเข้าไปในไซโทพลาซึมผู้รับ (Injecting donor cell into recipient cytoplasm)

หลังจากที่กำจัดนิวเคลียสออกจากไข่และแยกเซลล์ต้นแบบที่เลี้ยงไว้ให้เป็นเซลล์เดี่ยวๆ แล้ว จึงฉีดเซลล์ต้นแบบ ๑ เซลล์ เข้าไปในไข่ ซึ่งต้องทำภายใต้กล้องจุลทรรศน์หัวกลับกำลังขยาย ๒๐๐ เท่า โดยการดูดเซลล์ต้นแบบเข้าไว้ในหลอดแก้วขนาด ๑๖-๑๘ ไมครอน แล้วสอดผ่านรอยตัดเปลือกไข่เข้าไป หลังจากนั้นฉีดปล่อยเซลล์ต้นแบบให้เข้าไปอยู่ชิดกับผนังไซโทพลาซึมไข่

เซลล์ต้นแบบที่ถูกย่อยออกเป็นเซลล์เดี่ยว ด้วยน้ำยาย่อยเซลล์
๔. การเชื่อมเซลล์ต้นแบบให้ติดกับไซโทพลาซึมผู้รับ (Fusion donor cell with recipient cytoplasm)

หลังจากฉีดเซลล์ต้นแบบเข้าไปในไข่แล้ว จำเป็นต้องเชื่อมเซลล์ต้นแบบกับไข่ให้ติดกันด้วยกระแสไฟฟ้าอ่อนๆ เพื่อหลอมเซลล์ต้นแบบให้เข้ามาอยู่ภายในไซโทพลาซึมของไข่ โดยจัดให้เซลล์ต้นแบบ อยู่ในระนาบเดียวกับ อิเล็กโทรด จ่ายกระแสไฟฟ้า ทั้ง ๒ ด้าน แล้วจ่ายกระแสไฟฟ้า ๓๐ โวลต์ นาน ๑๕ ไมโครวินาที โดยทำ ๒ ครั้งเพื่อเชื่อมเซลล์ให้ติดกัน  หลังจากเชื่อมเซลล์เสร็จแล้วจะนำไข่ทั้งหมดไปพักไว้ในน้ำยานาน ๔๐-๕๐ นาที  แล้วนำไข่แต่ละใบมาตรวจสอบว่า เชื่อมกับเซลล์ต้นแบบเรียบร้อยแล้วหรือไม่

การเชื่อมเซลล์ต้นแบบกับไข่ด้วยกระแสไฟฟ้า
๕. การกระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัว (Activation for cell division)

ในธรรมชาติ เมื่อเกิดการปฏิสนธิระหว่างตัวอสุจิกับไข่ ตัวอสุจิจะส่งสัญญาณกระตุ้นให้ไข่เกิดการแบ่งตัว แต่ในกรณีของการโคลนนิ่งจะไม่มีตัวอสุจิเข้ามาเกี่ยวข้อง ดังนั้น จึงต้องกระตุ้นเทียมด้วยสารเคมี เพื่อให้เซลล์แบ่งตัว โดยคัดเลือกไข่ที่เชื่อมกับเซลล์ต้นแบบแล้ว และนำไปกระตุ้นโดยการเก็บไว้ในน้ำยาที่มีเอทานอล 7% นาน ๕ นาที จากนั้น นำไปเลี้ยงต่อในน้ำยาที่มีไซโคลเฮกซิไมด์ (cycloheximide) ๑๐ ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และไซโทชาลาซินดี (cytochalasin D) ๑.๒๕ ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในตู้อบเลี้ยงเซลล์ที่มีอุณหภูมิ ๓๘.๕ องศาเซลเซียส ภายใต้บรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% นาน ๕ ชั่วโมง

๖. การเลี้ยงตัวอ่อนโคลนนิ่งในหลอดแก้ว (In vitro culture of cloned embryo)

ไข่ที่ผ่านการกระตุ้นให้แบ่งตัวแล้ว นำมาเลี้ยงในน้ำยาเลี้ยงตัวอ่อนโค ในตู้อบเลี้ยงเซลล์ที่อุณหภูมิ ๓๘.๕ องศาเซลเซียส ภายใต้บรรยากาศที่มีออกซิเจน 5% คาร์บอนไดออกไซด์ 5% และ ไนโตรเจน 90% นาน ๒ วัน จากนั้น คัดเลือกตัวอ่อนระยะ ๘ เซลล์ไปเลี้ยงในน้ำยาเลี้ยงตัวอ่อนโค ในตู้อบเลี้ยงเซลล์ ที่อุณหภูมิ ๓๘.๕ องศาเซลเซียส ภายใต้บรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% นาน ๕ วัน โดยเลี้ยงร่วมกับเซลล์บุท่อนำไข่ของโค เนื่องจากเซลล์บุท่อนำไข่ สามารถหลั่งสารที่ช่วยให้ตัวอ่อนเจริญเติบโต โดยรวมแล้ว จะเลี้ยงตัวอ่อนในหลอดแก้ว นาน ๗ วัน ซึ่งจะได้ตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสต์ (blastocyst) ที่พร้อมฝังตัวในมดลูก หลังจากนั้น จึงทำการถ่ายโอนตัวอ่อน ไปยังมดลูกแม่โคตัวรับ

ตัวอ่อนโคระยะบลาสโทซีสต์
หลังจากเลี้ยงในหลอดแก้ว ๗ วัน

๗. การถ่ายโอนตัวอ่อนโคลนนิ่งสู่แม่ตัวรับ (Transfer cloned embryo to recipient)

โคที่จะนำมาเป็นตัวรับจะเป็นพันธุ์ใดก็ได้ โดยคัดเลือกเอาเฉพาะแม่โคที่มีระบบสืบพันธุ์ที่สมบูรณ์ดี มีการเป็นสัดสม่ำเสมอ และปลอดโรคติดต่อ โคสาวที่มีอายุระหว่าง ๑๖-๑๘ เดือนจะดีที่สุด เพราะโคสาวจะมีอัตราตั้งท้องหลังถ่ายโอนตัวอ่อนสูงกว่าโค ที่เคยมีลูกมาแล้ว ก่อนถ่ายโอนตัวอ่อนต้องเลี้ยงโคตัวรับให้พร้อมล่วงหน้า ๓-๔ เดือน เพื่อให้โคมีสุขภาพดี สามารถใช้ฮอร์โมนกระตุ้นให้โคเป็นสัดพร้อมกันครั้งละหลายๆ ตัว

ภาพเขียนแสดงการย้ายฝากตัวอ่อน ๑-๒ ใบใส่ปีกมดลูกของโค
ในขั้นตอนการผลิตตัวอ่อนโคโคลนนิ่งจะเลี้ยงตัวอ่อนไว้ ๗ วัน ดังนั้น ต้องคัดเลือกโคตัวรับที่เป็นสัดมาแล้ว ๗ วัน เพื่อให้ผนังมดลูกตรงกันกับอายุของตัวอ่อน ทำให้หลังจากถ่ายโอนตัวอ่อนจะมีโอกาสตั้งท้องสูง การถ่ายโอนตัวอ่อนโคลนนิ่งจำนวน ๑-๒ ใบเข้าสู่ปีกมดลูกของโคโดยการสอดท่อถ่ายโอนตัวอ่อนเข้าทางปากมดลูก ซึ่งไม่ต้องมีการผ่าตัด หลังจากนั้นนับไปอีก ๓๐ วัน จะตรวจการตั้งท้องด้วยอัลตราซาวนด์ โคตัวใดที่ตั้งท้องจะแยกออกมาเลี้ยง และล้วงตรวจการตั้งท้องทุกๆ เดือน จนกว่าจะครบกำหนดเกิดมา โดยปกติโคมีระยะเวลาตั้งท้อง ๒๘๐-๒๘๕ วัน อัตราการตั้งท้อง หลังการถ่ายโอนตัวอ่อนโคลนนิ่ง ในระยะ ๒ เดือนแรกคือ ร้อยละ ๓๐-๔๐ และอัตราการตั้งท้องจนครบกำหนดมีประมาณร้อยละ ๑๐
หัวข้อก่อนหน้า หัวข้อถัดไป