โดยหลักการแล้ว ขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่สำคัญ มีดังนี้

            ๑. เลือกส่วนของพืชที่ต้องการ เพื่อนำมาเลี้ยงด้วยวิธีที่เหมาะสม โดยรักษาสภาพเนื้อเยื่อ หรืออวัยวะนั้น ให้อยู่ในสภาพ ที่สามารถเจริญเติบโตต่อไปได้

            ๒. จัดเตรียมอาหารสังเคราะห์และสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม สำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เลือกไว้ เพื่อให้มีการเจริญเติบโตได้ ตามจุดมุ่งหมาย

            ๓. กำจัดเชื้อที่ติดมากับส่วนของพืช อาหารสังเคราะห์ อุปกรณ์ที่ใช้ ตลอดจนสภาพแวดล้อมในการเลี้ยง ให้อยู่ในสภาวะปลอดเชื้อ กล่าวคือ ให้ปราศจากจุลินทรีย์ เช่น แบคทีเรีย รา ฯลฯ ที่อาจปนเปื้อน ทั้งนี้ เพื่อป้องกันผลกระทบจากจุลินทรีย์เหล่านั้น ที่นอกจาก จะแย่งอาหารแล้ว ยังอาจสร้างสารยับยั้ง หรือรบกวนการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อพืชอีกด้วย

            เนื่องจากการเลือกส่วนของพืช ที่จะนำมาเลี้ยง มีผลโดยตรง ต่อความสำเร็จ ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ดังนั้น การเลือกส่วนของพืชจึงเป็นสิ่งแรกๆ ที่ควรพิจารณา ซึ่งต้องใช้ความรู้เกี่ยวกับส่วนต่างๆ ของพืชว่า ประกอบด้วยเซลล์และเนื้อเยื่อ ที่มีสมบัติแตกต่างกัน ทั้งในด้านลักษณะ และภาวะ ทางสรีรวิทยา การเจริญเติบโต หรือในบางกรณีจำนวนชุดของโครโมโซม ภายในเซลล์ อันส่งผลต่อ การเจริญที่คาดว่าจะได้รับ ตัวอย่างเช่น เนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอด ทำหน้าที่แบ่งเซลล์ เพื่อการเติบโต ของยอดตามธรรมชาติ เมล็ดมีเอ็มบริโอ ที่พร้อมจะเจริญเป็นต้นกล้า ส่วนต่างๆ ของต้นกล้า ประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่ยังอ่อนอยู่ และกำลังมีการเจริญ ตาข้างบนลำต้นจะเจริญไปเป็นกิ่ง ตลอดจน ช่อดอกอ่อน เหล่านี้ก็สามารถนำมาเลี้ยง และให้ผลดีกว่าส่วนของพืช ที่มีการเจริญจำกัด เช่น แผ่นใบ กลีบดอก เนื้อ และเปลือกผล ซึ่งเมื่อนำมาเลี้ยง อาจเติบโตได้เพียงระยะเดียว เว้นแต่จะกระตุ้นการเจริญด้วยการใช้สารควบคุมการเจริญ ได้แก่ ออกซิน และไซโทไคนิน ซึ่งจะสามารถชักนำให้เนื้อเยื่อถาวรกลับมามีสมบัติเป็นเนื้อเยื่อเจริญได้ใหม่ และแบ่งเซลล์เจริญเติบโตได้อีกครั้ง

            ส่วนต่างๆ ของพืชโดยทั่วไปประกอบด้วยเซลล์ที่มีโครโมโซม ๒ ชุด (2n) แต่ในบางส่วนของเนื้อเยื่อ และบางระยะ ของการเจริญเติบโตของพืช จะมีการสร้างเซลล์สืบพันธุ์ที่มีจำนวนโครโมโซม ลดลงครึ่งหนึ่ง ได้แก่ เซลล์ในอับเรณู และเซลล์ในออวูลภายในรังไข่ที่ยังไม่ได้รับการผสม เซลล์เหล่านี้ เมื่อนำมาเลี้ยง จะมีโอกาสได้ต้นพืช ที่มีจำนวนโครโมโซมลดลงครึ่งหนึ่ง สำหรับราก และส่วนที่เจริญใกล้ดิน ตลอดจนส่วนอื่นๆ ที่มีผิวไม่เรียบ หรือมีขนปกคลุมนั้น จำเป็นจะต้องระมัดระวัง เรื่องการปนเปื้อนจากจุลินทรีย์เป็นกรณีพิเศษ ตรงข้ามกับ ส่วนของพืชที่อยู่ภายใน หรือมีโครงสร้างบางอย่างห่อหุ้มไว้ เช่น เมล็ดที่อยู่ภายในผล เนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอด ซึ่งมีใบอ่อน หุ้มอยู่เป็นชั้นๆ ส่วนที่อยู่ภายในมักสะอาดกว่าส่วนที่สัมผัสกับภายนอก

            ในกรณีที่ต้องการเลี้ยงโพรโทพลาสต์เพื่อวัตถุประสงค์ในการรวมโพรโทพลาสต์ หรือแทรกใส่สารพันธุกรรม หรือยีน (gene) เข้าไปในโพรโทพลาสต์ จะมีขั้นตอน ของการเตรียมโพรโทพลาสต์ โดยอาจเตรียมจาก การนำใบ ที่ผ่านการฟอกฆ่าเชื้อแล้ว มาลอกผิวใบ ที่มีไขเคลือบอยู่ออกไป หรือใช้ใบหรือกลุ่มเซลล์ ที่เลี้ยงในสภาพปลอดเชื้ออยู่แล้ว ตัดให้เป็นชิ้นเล็กๆ แช่ในสารละลาย ที่มีเอนไซม์ย่อยผนังเซลล์ และมีการปรับสภาพเพื่อป้องกันไม่ให้โพรโทพลาสต์แตก โดยเอนไซม์จะย่อยผนังเซลล์ซึ่งอยู่ภายนอก ผลที่ได้คือ โพรโทพลาสต์ที่มีเพียงเยื่อหุ้ม จะถูกคัดแยก ไปเลี้ยงในอาหาร ที่เหมาะสม เพื่อใช้ตามวัตถุประสงค์ต่อไป